Về cuối đời, Gia Tĩnh rất khát khao được trường sinh bất lão. Để thỏa mong ước này, ông nhiều lần uống thuốc chế từ thủy ngân. Sau một thời gian dài uống thuốc, sức khỏe của hoàng đế bắt đầu suy kiệt; tứ chi sưng phù, sắc mặt xám xịt, chân bước không vững, nói năng cũng rất khó khăn.

Tháng giêng năm 1565, đạo sĩ Vương Châm (王针) ở Thiểm Tây đã bào chế ra thuốc kim thạch dựa vào Chư phẩm tiên phương, Dưỡng lão tân thư mà ông ta tự bịa ra. Thành phần của loại thuốc này không rõ ràng, sau khi Gia Tĩnh uống vào cảm thấy chóng mặt hoa mắt, chảy máu ở mũi, bất tỉnh, sau đó thì nằm liệt giường.

Năm 1567, Gia Tĩnh lại uống rất nhiều thuốc kim thạch để trường thọ nhưng sau đó trúng độc rất nặng, nhiều ngự y bó tay vì ông uống quá liều. Cuối cùng, vào ngày 23 tháng 1, một tuần trước Tết Nguyên Đán, Gia Tĩnh Đế lâm bệnh nặng và qua đời ở cung Vạn Thọ, thọ 60 tuổi.

Gia Tĩnh được dâng miếu hiệu là Thế Tông (世宗), thụy hiệu là Khâm Thiên Lý Đạo Anh Nghị Thần Thánh Tuyên Văn Nghiễm Vũ Hồng Nhân Đại Hiếu Túc Hoàng đế (欽天履道英毅聖神宣文廣武洪仁大孝肅皇帝), được an táng ở Vĩnh Lăng (永陵) trong Thập Tam Lăng.

Thời điểm Gia Tĩnh được chôn cất rất gần với thời điểm hoàn thành bản sao của bộ Vĩnh Lạc đại điển. Gia Tĩnh đế qua đời vào tháng 12 năm 1566 âm lịch, nhưng chỉ được chôn cất ba tháng sau đó, vào tháng 3 năm 1567.[8] Có một khả năng là triều đình đã cố gắng đợi bản thảo được hoàn thành.

Thái tử Chu Tái Hậu lên kế vị, tức Minh Mục Tông.